Laporan Praktikum Genetika: Isolasi DNA Buah

BAB 1

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

    Pada tahun 1869, seorang ahli ilmu kimia berkebangsaan Jerman bernama Friedrich Miescher menyelidiki susunan kimia dari nukleus sel. Ia mengetahui bahwa nukleus sel tidak terdiri dari karbohidrat, protein maupun lemak, melainkan terdiri dari zat yang mempunyai pengandungan fosfor yang tinggi. Oleh karena zat itu terdapat di dalam nukleus sel dan memiliki asam sebagai zat penyusunnya, maka zat itu disebut asam nukleat (DNA dan RNA) (Suryo, 2011).

    DNA terdiri atas dua rangkaian yang masing-masing merupakan urutan nukleotida secara linier. Semua nukleotida DNA mengandung satu molekul gula (deoksiribosa) dan satu gugus fosfat. Komponen ke tiga, yaitu satu basa nitrogen, yang muncul dalam empat bentuk (adenin: A; guanin: G; timin: T; sitosin: C), yang menghasilkan mepat macam nukleotida (Nicholas, 2004).

    Isolasi DNA adalah tahap terpenting dalam analisis molekuler. DNA memiliki struktur double-helix yang terdiri dari daerah fungsional (coding) dan non-fungsional (noncoding). Daerah ini memuat berbagai informasi penting. Seiring dengan perkembangan teknologi dalam bidang biologi, penggunaan DNA semakin sering diterapkan untuk menganalisis dan menyelesaikan berbagai permasalahan (Williams 2007). Keberadaan DNA total dapat dideteksi dengan teknik elektroforesis. Teknik elektroforesis merupakan suatu teknik mengukur perpindahan dan pergerakan partikel bermuatan (Khumairoh, dkk., 2016).

    Agar dapat lebih memahami isolasi DNA, maka perlu dilakukan sebuah praktikum untuk mempraktekkan teknik isolasi DNA secara langsung.

I.2 Tujuan Percobaan

Adapun tujuan dari percobaan lalat buah adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan atau mengisolasi DNA dari buah-buahan.
2. Mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi DNA.

I.3 Waktu dan Tempat Percobaan

    Adapun percobaan ini dilaksanakan pada hari --- pukul 14.00 – 17.00 WITA bertempat di Laboratorium Genetika, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Tinjauan Umum

    Informasi genetik dari organisme itu dibawa dalam molekul-molekul yang disebut asam nukleat. Semua organisme yang tubuhnya terdiri atas sel-sel menggunakan asam deoksiribonukleat (ADN) untuk menyimpan informasi genetik. Pada makhluk tingkat tinggi seperti cendawan, tumbuhan dan hewan (termasuk manusia), DNA tersimpan di dalam organel-organel dalam sel di mana organel yang terbesar adalah nukleus yang mengandung kromosom di mana tersimpan DNA.

    Asam nukleat tersusun atas nukleotida, yang bila terurai terdiri dari gula, fosfat dan basa yang mengandung nitrogen. Karenanya banyaknya nukleotida yang menysusun molekul DNA, maka molekul DNA merupakan suatu polinuleotida. Molekul gula yang menyusun DNA adalah sebuah pentosa, yaitu deoksiribosa, molekul fosfatnya berupa PO4 sementara basa nitrogennya dibedakan atas kelompok pirimidin (sitosis dan timin) dan purin (adenin dan guanin). Sel tumbuhan dan hewan mengandung kira-kira 1000 kali lebih banyak DNA daripada yang dimiliki sel bakteri (Suryo, 2011).

    Dua rangkaian yang membentuk satu molekul DNA dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang sangat spesifik antara purin dan pirimidin yang menghasilkan pasang basa A:T dan G:C. Karena A hanya berikatan dengan T, dan G hanya dengan C, satu rangkaian DNA bersifat komplemen dengan rangkaian lainnya; urutan basa pada salah satu rangkaian DNA dapat diduga berdasarkan urutan basa dari rangkaian komplemennya. Konsekuensi lebih jauh dari pengaturan pasangan semacam ini adalah bahwa dua rangkaian tersebut tersusun bersama dalam bentuk heliks. Karenam elibatkan dua rangkaian, susunan rangkaian yang demikian disebut heliks ganda (double-helix). Panjang dari sepotong DNA yang pendek biasanya diukur berdasarkan jumlah pasang basa (pb). Potongan yang lebih panjang diukur berdasarkan kilobasa (1 kb = 1.000 basa) atau bahkan megabasa (1 Mb = 1.000 kb) (Nicholas, 2004).

Gambar 2.1

Struktur DNA (Nicholas, 2004)

    Ekstraksi atau isolasi asam nukleat merupakan salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekμlar. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak dan lain-lain) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut (Hairuddin, 2013).

Gambar 2.2

Posisi DNA dalam Struktur Genom (Maftuchah, dkk., 2014)

    Isolasi DNA genom merupakan langkah awal dan sangat menentukan dalam studi genetika dan molekuler suatu spesies. Proses tersebut membutuhkan preparasi sampel untuk mendapatkan DNA dengan kualitas yang baik karena akan digunakan untuk berbagai analisis molekuler maupun manipulasi genetik. Analisis genom dilakukan untuk berbagai sampel dan untuk tiap sampel dibutuhkan optimasi agar diperoleh DNA yang baik dalam jumlah besar. Isolasi atau pengambilan DNA dari makhluk hidup terbagi atas beberapa tahapan yaitu penghancuran sel, penghilangan RNA dan protein serta pemurnian dan pengendapan DNA.

    Sel tanaman dilindungi oleh membran sel dan dinding sel yang kuat. Membran sel terdiri dari ikatan antara protein dan lemak, sedangkan dinding sel tersusun atas polisakarida. Dinding sel dan membran sel harus dipecah untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel. Penghancuran sel dapat dilakukan dengan cara mekanik, kimiawi dan enzimatik. Proses tersebut dipengaruhi oleh kuantitas, kualitas dan proses penghancuran itu sendiri (Ferniah dan Pujiyanto, 2013).

    Pada tahun 1868, seorang mahasiswa kedokteran Swedia, J.F. Miescher, menemukan suatu zat kimia bersifat asam yang banyak mengandung nitrogen dan fosfor. Zat ini diisolasi dari nukleus sel nanah manusia dan kemudian dikenal dengan nama nuklein atau asam nukleat. Meskipun ternyata asam nukleat selalu dapat diisolasi dari nukleus berbagai macam sel, waktu itu fungsinya sama sekali belum diketahui (Susanto, 2011).

II.2 Prinsip dan Metode Isolasi DNA

    Identifikasi molekuler memerlukan tahapan awal, yaitu isolasi DNA genom. Prinsip isolasi DNA adalah mendapatkan DNA murni yang tidak tercampur dengan komponen sel lainnya seperti protein dan karbohidrat. Isolasi DNA genom dapat dilakukan dengan metode lisis sel secara fisik dan kimia. Secara fisik sel dipecah dengan kekuatan mekanik, yaitu secara bead mill homogenization dan resonansi misalnya dengan sonikasi. Sedangkan secara kimia sel dirusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barrier dinding sel, misalnya SDS (Sodium Dedocyl Sulfate) dan CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide). Kualitas DNA genom yang baik merupakan hal penting yang dibutuhkan dalam aplikasi biologi molekuler. Aplikasi tersebut meliputi PCR (Polymerase Chain Reaction), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), dan analisis molekuler yang lain (Murtiyaningsih, 2017).

    Terdapatnya perbedaan eksperimen atau teknik analisis memerlukan tingkat kemurnian DNA yang berbeda. Sebagai contoh, analisa Southern Blot yang didasarkan pada enzim restriksi dan hibridisasi memerlukan hasil DNA yang murni. Sebaliknya, untuk melakukan analisis Polymerase Chain Reaction (PCR), dapat dilakukan hasil isolasi DNA dengan kualitas sedang.

    PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplikasi DNA secara in-vitro yang cepat dan kuat. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) merupakan salah satu penanda molekuler berbasis PCR yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada tingkat intraspesies maupun antarspesies. Teknik ini mendeteksi polimorfisme ruas nukleotida pada DNA dengan menggunakan sebuah primer tunggal yang memiliki rangkaian nukleotida acak (Uslan dan Pharmawati, 2015).

Gambar 2.3

Profil PCR-RADP pada hasil isolasi DNA (Uslan dan Pharmawati, 2015)

    Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah pemisahan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Dalam proses isolasi DNA, strategi optimasi yang paling penting adalah terletak pada komposisi dari buffer ekstraksi dan pH, sehingga senyawa esensial yang dapat mencegah DNA dari proses degradasi seharusnya terkandung dalam buffer ekstraksi yang digunakan. Pada organisme eukariot, proses ekstaksi DNA dilakukan melalui penghancuran dinding sel, penghilangan protein dan RNA, serta pengendapan DNA. Hasil isolasi DNA adalah tahapan yang penting untuk keberhasilan proses berikutnya. Oleh karena itu, isolasi DNA harus dilaksanakan sebaik-baiknya dan diupayakan bebas dari kontaminan (Maftuchah, dkk., 2014)

Gambar 2.3

Hasil Isolasi DNA Tanaman (Maftuchah, dkk., 2014)

    Langkah awal isolasi DNA tumbuhan adalah dengan menguliti buah yang ingin diekstrak. Langkah ini merupakan proses penghancuran jaringan, karena DNA terdapat di dalam sel. Untuk menghancurkan jaringan ini, dapat dilakuka dengan 2 cara, yakni secara fisik atau kimiawi. Secara fisik dapat menggunakan blender atau alat penumpuk, sedangkan secara kimiawi dapat menggunakan reagen yang mampu melisiskan jaringan dan sel.

    Selanjutnya, larutan ditambahkan garam dan deterjen. Deterjen berfungsi untuk melisiskan barrier sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia seperti etil endiamintetra asetat (EDTA). Deterjen dapat mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel. Adapun fungsi penambahan garam adalah untuk memberikan kondisi ionik sehingga reaksi berjalan lebih stabil dan juga untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi. Setelah campuran disaring, maka ditambahkan alkohol sebagai bahan presipitasi DNA agar yang telah terkumpul mampu memisah dari larutan (Nugroho dan Rahayu, 2016).

Gambar 2.4

Hasil Isolasi DNA Tumbuhan (Nugroho dan Rahayu, 2016)

II.3 Peranan dan Manfaat Isolasi DNA

    Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total DNA/RNA dari jaringan adalah memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang menganduk DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan. Adapun manfaat isolasi DNA secara umum (Suryo, 2011), yakni sebagai berikut:

1. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gelombang.
2. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara matematik melalui teknik hibridisasi southern.
3. Isolasi DNA genetik dalam rangka pembuatan genomik.
4. Isolasi plasmid atau DNA fage prosedur pemindahan DNA.

BAB III

METODE PERCOBAAN

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat

    Alat-alat yang digunakan dalam melakukan percobaan ini adalah blender, pisau, mesin vortex, gelas beaker, tabung reaksi, sendok, dan corong.

III.1.2 Bahan

    Bahan-bahan yang digunakan dalam melakukan percobaan ini adalah buah alpukat, kertas saring, garam, deterjen cair, deterjen bubuk, alkohol 96%, dan akuades.

III.2 Prosedur Kerja

Adapun prosedur kerja percobaan ini adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Dihaluskan 100 g alpukat dengan blender.
3. Dilarutkan 10 g deterjen ke dalam 50 mL akuades lalu ditambahkan garam seperlunya.
4. Dicampurkan 4 ml masing-masing deterjen ke dalam 4 buah tabung reaksi (2 tabung untuk deterjen bubuk dan 2 tabung untuk deterjen cair.
5. Salah satu dari 2 jenis tabung divortex (perlakuan).
6. Campuran kemudian disaring sebanyak 3 kali.
7. Ditambahkan 5 ml alkohol dingin konsentrasi 96%.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

IV.1.1 Deterjen bubuk

1. Tanpa divortex

Gambar 4.1

Deterjen bubuk tanpa divortex

2. Dengan divortex

Gambar 4.2

Deterjen bubuk dengan divortex

IV.1.2 Deterjen cair

1. Tanpa divortex

Gambar 4.3

Deterjen cair tanpa divortex

2. Dengan divortex

Gambar 4.4

Deterjen cair dengan divortex

IV.2 Pembahasan

    Isolasi DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA dari molekul-molekul lain yang ada di dalam inti sel. Teknik isolasi DNA dapat dilakukan dengan 3 prinsip, antara lain lisis, presipitasi dan purifikasi. Lisis merupakan tahap pemurnian, presipitasi merupakan tahap pengendapan dan purifikasi merupakan tahap pemurnian.

    Adapun tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui cara atau metode yang benar untuk memisahkan atau mengisolasi DNA dari buah-buahan serta mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi DNA. Dalam percobaan, digunakan buah alpukat Persea americana sebagai buah yang DNA-nya akan diisolasi. Buah dipotong-potong kemudian ditimbang sesuai dengan komposisinya lalu dihaluskan dengan blender. Setelah itu dibuat larutan deterjen bubuk maupun cair dengan komposisi 50 mL aquades dan 10 g deterjen, kemudian ditambahkan garam secukupnya. 4 mL larutan deterjen kemudian dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi untuk kemudian salah satu dari dua jenis tersebut divortex. Setelah dilakukan penyaringan sebanyak 3 kali, maka ditambahkan 5 mL alkohol dingin dengan konsentrasi 96%.

    Dari rangkaian proses yang telah dilakukan, maka diperoleh hasil di mana deterjen bubuk dengan tanpa divortex mengendapkan sedikit DNA sementara dengan divortex mengendapkan banyak DNA. Sementara untuk deterjen cair, dengan divortex, didapatkan banyak DNA sementara dengan tanpa divortex, hanya sedikit DNA yang didapatkan. Namun jika dilakukan perbandingan antara hasil deterjen bubuk dengan divortex dan deterjen cair tanpa divortex yang di mana keduanya sama-sama memunculkan banyak molekul DNA, larutan dengan deterjen bubuk merupakan larutan yang menghasilkan DNA lebih banyak. Hal tersebut menunjukkan bahwa deterjen bubuk memiliki kemampuan yang lebih baik dalam melakukan pemisahan DNA. Namun DNA yang dihasilkan dari percobaan ini bukanlah DNA murni karena sumber DNA yang digunakan berasal dari serat buah.

BAB V

PENUTUP

V.1 Kesimpulan

Adapun kesimpulan yang didapatkan dari percobaan yang telah dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Mengisolasi DNA dari buah-buahan dapat dilakukan dengan menerapkan tiga prinsip isolasi DNA, yakni lisis, presipitasi, dan purifikasi.
2. Dari hasil yang didapatkan, deterjen bubuk memiliki keefektifan yang lebih baik dalam melakukan isolasi DNA. Adapun DNA yang dihasilkan cukup banyak, hal ini disebabkan karena buah yang digunakan, yakni alpukat Persea americana merupakan buah dengan kandungan air yang terbilang sedikit. Semakin sedikit kadar air buah yang digunakan, maka akan memunculkan DNA yang lebih banyak pula.

V.2 Saran

V.2.1 Saran untuk Laboratorium

Sebaiknya dilakukan pengadaan evaluasi fasilitas laboratorium.

V.2.2 Saran untuk Asisten

Kinerja asisten telah baik maka sebaiknya dapat dipertahankan.

V.2.3 Saran untuk Praktikan

Sangat diperlukan kerjasama antar setiap anggota kelompok dalam menyediakan keperluan alat dan bahan percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

Ferniah, R.S. dan S. Pujiyanto, 2013. Optimasi Isolasi DNA Cabai (Capsicum annuum L.) berdasarkan Perbedaan Kualitas dan Kuantitas Daun serta Teknik Penggerusan. Jurnal BIOMA. Vol. 156(1): 14-19.

Hairuddin, R., 2013. Isolasi DNA dan Amplifikasi, (PCR) Genom DNA Kopi (Coffea Sp.) melalui Proses Elektroforesis Gel Poliakrilamid. Jurnal Dinamika. Vol. 4(1): 43-48.

 

Khumairoh, S., D.W. Roslim dan Herman, 2016. Teknik Isolasi DNA Total pada Tumbuhan Tuntun Angin (Elaeocarpus floribundus) dari Provinsi Riau. Jurnal Riau Biologia. Vol. 1(2): 118-123.

 

Maftuchah, A. Winaya dan A. Zainuddin, 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi Molekuler. Deepublish, Yogyakarta.

 

Murtiyaningsih, H., 2017. Isolasi DNA Genom dan Identifikasi Kekerabatan Genetik Nanas Menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Jurnal Agritrop. Vol. 15(1): 83-93.

 

Nugroho, E.D. dan D.A. Rahayu, 2016. Penuntun Praktikum Bioteknologi. Deepublish, Yogyakarta.

 

Uslan dan M. Pharmawati, 2015. Optimasi Konsentrasi DNA dan MgCl2 pada Reaksi Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA untuk Analisis Keragaman Genetik Tanaman Faloak (Sterculia quadrifida  R.Br). Jurnal Bioslogos. Vol. 5(1): 26-34.

 

Suryo, 2011. Genetika Manusia. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

 

Susanto, A.H., 2011. Genetika. Graha Ilmu, Yogyakarta.

 

Wati, M., R.R.P. Megahati dan W.N. Sari, 2015. Pola Khas yang Ditemukan pada Sidik Jari dan Telapak Tangan pada Anak-Anak Tuna Netra di Kota Padang. Jurnal BioCONCETTA. Vol. 1(2): 59-66.

Tidak untuk disalin! 

Artikel ini dibagikan untuk memberi contoh dan menginspirasi:)