Laporan Praktikum Bioteknologi: Uji Antibakteri Ekstrak Tanaman Citrus aurantifolia

Daftar Isi

• Tujuan Praktikum
• Dasar Teori
• Metode Kerja
• Ekstraksi
• Uji Antibakteri
• Hasil dan Pembahasan
• Hasil Ekstraksi
• Hasil Uji Antibakteri
• Daftar Pustaka

TUJUAN PRAKTIKUM

1. Mampu melakukan ekstraksi senyawa bioaktif dari daun jeruk nipis Citrus aurantifolia menggunakan metode maserasi.
2. Mampu melakukan pengujian aktivitas antibakteri dari ekstrak metanol daun jeruk nipis Citrus aurantifolia terhadap bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

 

DASAR TEORI

A. Jeruk nipis Citrus aurantifolia

Jeruk nipis Citrus aurantifolia berasal dari familia Rutaceae yang tumbuh di daerah subtropik maupun tropik, termasuk di Indonesia. C. aurantifolia adalah salah satu tanaman yang banyak digunakan oleh masyarakat Indonesia, baik sebagai bumbu masakan ataupun secara empirik digunakan sebagai obat seperti obat batuk, meluruhkan dahak, influenza, dan jerawat (Chusniah dan Muhtadi, 2017). Disebutkan dalam Lestari et al. (2018), bahwa C. aurantifolia mengandung unsur-unsur senyawa kimia yang bermanfaat, seperti asam sitrat, asam amino (triptofan, lisin), minyak atsiri, glikosida, asam sitrun, lemak, kalsium, fosfor, besi, belerang, vitamin B1, dan vitamin C. Penelitian-penelitian yang telah dilakukan sebelumnya menemukan bahwa C. aurantifolia memiliki efek bakterisidal karena kandungan kimia seperti minyak atsiri dan fenol. Selain itu, ditemukan pula efek bakteriostatik yakni bersifat menghambat pertumbuhan berbagai jenis bakteri.

 

B. Ekstraksi

Senyawa dari tumbuhan dapat diperoleh dengan cara ekstraksi yang bertujuan untuk memperoleh kandungan zat aktif dari suatu bahan alam dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Berbagai teknik ekstraksi telah berkembang mulai dari penggunaan alat yang sederhana sampai penggunaan alat yang modern. Ekstraksi menggunakan pelarut terdiri dari cara dingin dan cara dingin. Ekstraksi cara dingin antara lain maserasi dan perkolasi, sedangkan contoh ekstraksi cara panas antara lain refluks, soxhletasi, dan dekok (Wijaya et al., 2018). Metode-metode ekstraksi tersebut akan dijelaskan sebagai berikut.

1. Metode dingin

a. Maserasi

Maserasi dilakukan dengan pengadukan larutan simplisia dan pelarut lalu didiamkan dalam suhu ruang (Wijaya et al., 2018). Setelah didapatkan kesetimbangan konsentrasi senyawa, maka dilakukan penyaringan untuk memisahkan sampel dari pelarut (Mukhriani, 2014). Metode ini digunakan oleh Priono et al. (2016) untuk mengekstrak kandungan senyawa antibakteri dari daun kelor dan kirinyuh. Menurut Mukhriani (2014), kelebihan metode ini adalah dapat menghindari rusaknya senyawa-senyawa yang bersifat termolabil atau tidak tahan panas. Sedangkan kekurangannya adalah penggunaan pelarut yang cukup banyak dan besarnya kemungkinan hilangnya beberapa senyawa akibat proses serta jangka waktu yang lama.

b. Perkolasi

Perkolasi adalah proses ekstraksi dengan pergantian pelarut baru secara terus-menerus sehingga tidak terjadi kejenuhan pelarut. Metode ini menggunakan alat berupa perkolator. Metode perkolasi membutuhkan waktu yang lebih sedikit dibandingkan pada maserasi, tetapi menggunakan lebih banyak pelarut serta membutuhkan keahlian tertentu (Patel et al., 2019). Rosidah et al. (2017) menggunakan metode ini untuk mengekstraksi senyawa total fenolik buah labu siam Sechium edule.

2. Metode panas

a. Refluks

Refluks adalah cara ekstraksi dengan pelarut yang sesuai pada temperatur titik didihnya selama waktu tertentu dan dalam jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan terhadap pendingin balik (Rusdi et al., 2018). Metode ini lebih efisien serta membutuhkan jumlah pelarut yang lebih sedikit (Wijaya et al., 2018), tetapi senyawa termolabil dapat terdegradasi (Mukhriani, 2014). Metode refluks digunakan dalam Rusdi et al. (2018) untuk mengekstrak senyawa flavonoid pada batang Boehmeria virgata.

b. Sokletasi

Ekstraksi soklet merupakan metode ekstraksi komponen secara kontinu dari campuran padat menggunakan alat khusus, yakni soklet. Jumlah pelarut yang digunakan sedikit tetapi menghasilkan produk ekstraksi dalam jumlah besar (Patel et al., 2019). Namun, kelemahan metode ini adalah tidak dapat digunakan untuk senyawa termolabil (Mukhriani, 2014). Metode ini digunakan oleh Wijaya et al. (2018) dalam mengekstrak daun rambai laut Sonneratia caseolaris dengan bantuan pelarut polar etanol.

c. Dekok

Dekok adalah perebusan pada suhu di titik didih air, yakni suhu 90-100 °C dengan waktu yang lebih lama. Sama seperti metode ekstraksi panas lainnya, metode dekok juga membutuhkan jumlah pelarut yang sedikit serta membutuhkan waktu yang lebih singkat dibanding metode ekstraksi lainnya. Metode ini banyak digunakan untuk mendapatkan ekstrak daun tanaman, contohnya ekstrak daun sirih hijau Piper betle (Marsono et al., 2017).

3. Pelarut

Senyawa yang bersifat nonpolar akan larut dalam pelarut nonpolar, senyawa semipolar akan larut ke dalam pelarut semipolar, sedangkan senyawa yang bersifat polar akan larut ke dalam pelarut polar (Harbone, dalam Sayuti, 2017). Oleh karena itu, terdapat 3 jenis pelarut, yakni pelarut nonpolar, semipolar, dan polar. Contoh pelarut polar adalah air, etanol, dan metanol. Contoh pelarut semipolar adalah etil asetat dan diklorometan. Sedangkan contoh pelarut nonpolar adalah n-heksan, petroleum eter, dan kloroform (Mukhriani, 2014). Sayuti (2017) membandingkan pengaruh perbedaan jenis pelarut terhadap hasil rendemen dan aktivitas antioksidan bambu laut Isis hippuris. Digunakan ketiga jenis pelarut, yakni metanol (polar), etil asetat (semipolar), dan n-heksan (nonpolar). Hasil menunjukkan keefektifan metanol adalah yang paling tinggi dibanding kedua jenis pelarut lainnya.

4. Bakteri uji

Bakteri yang dapat bersifat patogen pada manusia antara lain Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Priono et al., 2016). Staphylococcus aureus merupakan salah satu bakteri Gram-positif berbentuk bulat yang bersifat patogen bagi manusia. Staphylococcus aureus juga dapat menginfeksi jaringan atau alat tubuh lain yang menyebabkan timbulnya penyakit dengan tanda-tanda yang khas seperti nekrosis, peradangan, dan pembentukan abses (Lauma et al., 2015). Selain itu, bakteri ini dapat menghasilkan enterotoksin yang dapat menyebabkan keracunan makanan dalam jangka waktu pendek (Brooks, dalam Priono et al., 2016). Sementara itu, beberapa penyakit yang banyak dijumpai dalam kehidupan manusia umumnya juga disebabkan oleh bakteri patogen Gram-negatif. Salah satu bakteri patogen yang termasuk dalam kelompok Gram-negatif adalah Escherichia coli. Bakteri ini dapat menyebabkan penyakit diare pada manusia (Priono et al., 2016).

 

METODE KERJA

A. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah blender kering, nampan, kuas, gelas ukur, gelas kimia, timbangan digital, evaporator, toples kaca, erlenmeyer, corong, cawan petri, spuit, pencadang (silinder), membran filter, inkubator, oven, bunsen, pinset, dan botol. Sedangkan bahan yang digunakan adalah daun jeruk nipis Citrus aurantifolia L., metanol, kertas saring, isolat bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, medium NA, aluminium foil, wrap plastic, dan tisu.

B. Prosedur Kerja

1. Ekstraksi

1. Daun jeruk nipis Citrus aurantifolia dikeringkan di bawah sinar matahari langsung selama 24 jam kemudian dimasukkan ke dalam oven pada suhu 40 °C selama 24 jam.
2. Daun dihaluskan dengan menggunakan blender kering.
3. Simplisia direndam di dalam toples tertutup menggunakan metanol selama 24 jam. Rendaman lalu disaring untuk memisahkan filtrat dan ampas.
4. Direndam kembali di dalam toples tertutup menggunakan metanol selama 24 jam lalu disaring untuk memisahkan filtrat dan ampas. Ampas lalu dibuang.
5. Filtrat dievaporasi pada suhu 37 °C sehingga didapatkan ekstrak metanol daun jeruk nipis.

2. Uji Antibakteri

A. Penyiapan bakteri uji Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

Biakan murni Escherichia coli dan Staphylococcus aureus diremajakan terlebih dahulu dengan cara ditumbuhkan pada media agar miring NA dan diinkubasi selama 24 jam. Isolat bakteri kemudian disuspensikan menggunakan NaCl 0,9% dan diukur kekeruhannya menggunakan spektrofotometer sehingga diperoleh nilai transmitan 25%.

B. Uji antibakteri ekstrak daun jeruk nipis Citrus aurantifolia terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

Pengujian daya hambat dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan pencadang. Sebanyak 20 mL media NA dituang ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga memadat. Lapisan ini disebut dengan base layer. Selanjutnya suspensi bakteri uji dicampurkan dengan media NA dan dituang ke atas permukaan base layer sebanyak 15 mL. Lapisan ini disebut sebagai seed layer. Pada saat seed layer telah agak memadat, pencadang diletakkan di atas permukaan media dengan menyesuaikan jarak antar pencadang dan jarak dengan tepi cawan. Ekstrak tanaman dimasukkan ke dalam pencadang secara hati-hati menggunakan spuit. Setelah diinkubasi selama 1 × 24 jam, kultur diamati dan diukur diameter hambatan yang terbentuk.

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Ekstraksi

Ekstrak tanaman yang diambil dalam praktikum adalah daun jeruk nipis Citrus aurantifolia. Daun tanaman dikeringkan terlebih dahulu agar lebih mudah dihaluskan. Daun jeruk nipis kemudian dihaluskan menggunakan blender kering sehingga didapatkan serbuk daun (simplisia). Simplisia kemudian dimasukkan ke dalam toples kaca tertutup lalu direndam selama 1 × 24 jam menggunakan metanol sebagai pelarut organik yang dapat melarutkan analit polar maupun nonpolar seperti alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid dari tanaman (Agustina et al., 2018). Berat molekul pelarut metanol termasuk rendah sehingga mampu membuat ikatan hidrogen dan bisa bercampur serta larut dengan H₂O sampai dengan kelarutan yang tak terhingga (Sayuti, 2017).

Setelah difiltrasi, dilakukan remaserasi. Penyarian dilakukan berulang-ulang agar komponen atau senyawa kimia dalam sampel dapat terisolasi dengan baik (Wijaya 2018). Metode maserasi adalah metode ekstraksi yang dilakukan tanpa pemanasan sehingga metode ini dapat mencegah rusak atau terdegradasinya senyawa termolabil (Agustina et al., 2018). Hasil maserasi pertama dan kedua kemudian dicampur dan dievaporasi pada suhu 37 °C menggunakan evaporator. Penggunaan alat ini dipilih karena mampu menguapkan pelarut, yakni metanol, di bawah titik didihnya (titik didih metanol = 64,5 °C) sehingga zat yang terkandung di dalam hasil ekstraksi tidak rusak oleh suhu tinggi (Pangestu & Handayani, dalam Damayanti dan Fitriana, 2012).

2. Hasil Uji Antibakteri

Tabel 1. Hasil pengamatan diameter hambatan ekstrak metanol daun jeruk nipis terhadap pertumbuhan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus

Bakteri Uji	Diameter Zona Hambatan (mm)
	Ekstrak Tanaman	Ciprofloxacin
Escherichia coli	21,5	23,5
Staphylococcus aureus	23	24

 

Pengujian daya hambat ekstrak metanol daun jeruk nipis dilakukan terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus menggunakan metode difusi agar dengan pencadang. Penyiapan media kultur dimulai dengan menuangkan media NA ke dalam cawan petri dengan membentuk 2 lapisan, yakni lapisan dasar (base layer) dan lapisan pembenihan (seed layer) yang telah dicampurkan dengan isolat bakteri E. coli dan S. aureus. Lapisan seed layer juga merupakan lapisan peyangga pencadang yang diletakkan setelah seed layer agak memadat. Selanjutnya, ekstrak kedua jenis daun dimasukkan ke dalam pencadang menggunakan spuit. Selain itu diberi pula kontrol positif berupa ciproflaxin. Setelah inkubasi dilakukan pengukuran diameter zona hambat menggunakan penggaris.

Dari hasil pengukuran pada Tabel 1., tampak bahwa ekstrak metanol tanaman uji memiliki daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri E. coli dan S. aureus. Ekstrak metanol daun jeruk nipis membentuk diameter zona hambat 21,5 mm pada media kultur E. coli dan 23 mm pada media kultur S. aureus.  Sementara itu, diameter zona hambat ciprofloxacin terhadap E. coli adalah 23,5 mm sedangkan pada S. aureus adalah 24 mm. Ciprofloxacin bekerja dengan menghambat kerja enzim DNA girase, yakni enzim topoisomerase II yang penting dalam proses replikasi DNA (Rossiter et al., 2017). Menurut Mulangsri et al. (2019), perbedaan kepekaan bakteri terhadap antibiotik kemungkinan dikarenakan adanya perbedaan penyusun dinding sel misalnya ketebalan peptidoglikan dan adanya lipid, antara tipe bakteri Gram-positif (S. aureus) dan Gram-negatif (E. coli). Hal ini didukung oleh Abdallah (2016) dalam penelitiannya yang membandingkan efektivitas antibakteri terhadap beberapa jenis bakteri Gram-positif dan Gram-negatif. Hasil penelitian tersebut mendapatkan efektivitas antibakteri terhadap bakteri Gram-positif lebih besar dibandingkan terhadap bakteri Gram-negatif. Lathifah, dalam Berlian et al. (2016) menyebutkan bahwa S. aureus merupakan bakteri Gram-positif yang memiliki struktur dinding sel berlapis tunggal dan tersusun atas peptidoglikan (protein dan gula) serta lipid dengan kadar rendah (1-4%) sehingga ekstrak metanol lebih mudah menembus dinding sel bakteri ini. Sedangkan E. coli yang merupakan bakteri Gram-negatif lebih sulit ditembus senyawa yang bersifat polar karena struktur dinding selnya berlapis tiga dan tersusun atas peptidoglikan dan lipid dengan kadar yang tinggi (11-22%). Dinding sel bakteri S. aureus yang tipis menyebabkan lebih mudahnya transpor senyawa antimikroba secara osmosis ke dalam sel bakteri sehingga pengaruh antimikroba yang diberikan pun lebih besar. Adapun daya hambatan yang diberikan oleh ekstrak tanaman uji berasal dari kandungan senyawa metabolik yang dihasilkan oleh tanaman. Hasil skrining fitokimia Abdallah (2016) pada ekstrak daun metanol Citrus aurantifolia mendapatkan senyawa-senyawa antimikroba seperti alkaloid, tanin, flavonoid, saponin, dan senyawa fenolik. Berlian (2016) menambahkan bahwa kandungan minyak atsiri seperti fenol memiliki sifat bakterisidal. Saponin yang terkandung juga dapat mengakibatkan naiknya permebilitas atau kebocoran sel bakteri yang berujung pada keluarnya senyawa intraseluler (lisis). 

 

DAFTAR PUSTAKA

Abdallah, E.M., 2016. Preliminary Phytochemical and Antibacterial Screening of Methanolic Leaf Extract of Citrus aurantifolia. Pharmaceutical Biotechnology: Current Research, 1(2), pp.1-5.

 

Agustina, E., Andiarna, F., Lusiana, N., Purnamasari, R., & Hadi, M.I., 2018. Identifikasi Senyawa Aktif dari Ekstrak Daun Jambu Air (Syzygium aqueum) dengan Perbandingan Beberapa Pelarut pada Metode Maserasi. Jurnal Biotropic, 2(2), pp.108-118.

 

Berlian, Z., Fatiqin, A., & Agustina, E., 2016. Penggunaan Perasan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) dalam Menghambat Bakteri Escherichia coli pada Bahan Pangan. Bioilmi: Jurnal Pendidikan, 2(1), pp.51-58.

 

Chusniah, I. & Muhtadi, A., 2017. Aktivitas Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) sebagai Antibakteri, Antivirus, Antifungal, Larvasida, dan Anthelmintik. Farmaka, 15(2), pp.9-22.

 

Damayanti, A. & Fitriana, E.A., 2012. Pemungutan Minyak Atsiri Mawar (Rose Oil) dengan Metode Maserasi. Jurnal Bahan Alam Terbarukan, 1(2), pp.1-8.

 

Lauma, S.W., Pangemanan, D.H.C, & Hutagalung, B.S.P., 2015. Uji Efektifitas Perasan Air Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) terhadap Pertumbuhan Bakteri Staphylococcus aureus secara In Vitro. Pharmacon, 4(4), pp.9-15.

 

Marsono, O.S., Susilorini, T.E., & Surjowardojo, P., 2017. Pengaruh Lama Penyimpanan Dekok Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) terhadap Aktivitas Daya Hambat Bakteri Streptococcus agalactiae Penyebab Matitis pada Sapi Perah. Jurnal Ilmu dan Teknologi Hasil Ternak (JITEK), 12(1), pp.47-60.

 

Mukhriani, 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi Senyawa Aktif. Jurnal Kesehatan, 7(2), pp.361-367.

 

Mulangsri, D.A.K., Laksanasari, R., Amaliyah, R., Fitri, A., & Kusumadewi, A.P., 2019. Aktivitas Antibakteri Beberapa Fraksi Ekstrak Daun Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia Swingle) terhadap Bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. Jurnal Ilmiah Cendekia Eksakta, 4(1), pp.1-6.

 

Patel, K., Panchal, N., & Ingle, P., 2019. Techniques Adopted for Extraction of Natural Products: Extraction Methods: Maceration, Percolation, Soxhlet Extraction, Turbo Distillation, Supercritical Fluid Extraction. International Journal of Advanced Research in Chemical Science (IJARCS), 6(4), pp.1-12.

 

Priono, A., Yanti, N.A., & Darlina, L., 2016. Perbandingan Efektivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Kelor (Moringa oleifera Lamck.) dan Ekstrak Daun Kirinyuh (Chromolaena odorata L.). J. AMPIBI, 1(2), pp.1-6.

 

Rossiter, S.E., Fletcher, M.H. & Wuest, W.M., 2017. Natural Products as Platforms to Overcome Antibiotic Resistance. Chemical Reviews, 117(19), pp.12415-12474.

 

Rosidah, I., Zainuddin, Mufidah, E., Bahua, H., & Saprudin, M., 2017. Optimasi Kondisi Ekstraksi Senyawa Total Fenolik Buah Labu Siam (Sechium edule (Jacq.) Sw.) Menggunakan Response Surface Methodology. Media Litbangkes, 27(2), 79-88.

 

Rusdi, M., Hasan, T., Ardillah, A., & Evianti, E., 2018. Perbandingan Metode Ekstraksi terhadap Kadar Flavonoid Total dan Aktivitas Antioksidan Batang Boehmeria virgata. ad-Dawaa' Journal of Pharmaceutical Sciences, 1(1), pp.16-24.

Sayuti, M., 2017. Pengaruh Perbedaan Metode Ekstraksi, Bagian dan Jenis Pelarut terhadap Rendemen dan Aktifitas Antioksidan Bambu Laut (Isis hippuris). Technology Science and Engineering Journal, 1(3), pp.166-174.

 

Wijaya, H., Novitasari, & Jubaidah, S., 2018. Perbandingan Metode Ekstraksi terhadap Rendemen Ekstrak Daun Rambai Laut (Sonneratia caseolaris L. Engl). Jurnal Ilmiah Manuntung, 4(1), pp.79-83.

Tidak untuk disalin! 

Artikel ini dibagikan untuk memberi contoh dan menginspirasi:)