Laporan Praktikum Bioteknologi: Teknik Isolasi DNA Bakteri

Daftar Isi

• Tujuan Praktikum
• Dasar Teori
• Metode Kerja
• Hasil dan Pembahasan
• Daftar Pustaka

TUJUAN PRAKTIKUM

1. Mampu melakukan pemisahan (mengisolasi) DNA dari Bakteri Asam Laktat.
2. Mampu melakukan pengujian keefektifan deterjen dari bakteri yang dipakai untuk melakukan isolasi DNA.

DASAR TEORI

DNA sebagai pembawa informasi genetik terdapat pada semua makhluk hidup, yakni di dalam sel khususnya di inti sel. DNA dapat diperoleh dari suatu makhluk hidup dengan suatu proses ekstraksi, disebut proses isolasi DNA (Langga et al., 2012). Isolasi asam nukleat melibatkan berbagai metode yang mencakup penghancuran sel tanpa menyebabkan kerusakan DNA. Umumnya penghancuran sel dilakukan di dalam buffer ekstraksi yang menghambat kerja enzim RNase dan DNase (Syahputra, 2016). Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dan lain-lain) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut (Hairuddin, 2013).

Proses isolasi/ekstraksi dilakukan dengan cara merusak atau memecahkan dinding sel sehingga DNA keluar dari dalam sel (Sunarno et al., 2014). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Syafaruddin et al., 2011). Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium buffer monosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan detergen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan Sodium Dodesil Sulfat (SDS). Langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Pembuangan komponen lainnya dilakukan dengan sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform. Presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap selanjutnya disentrifugasi kembali dan dihancurkan secara enzimatis dengan protease (Utami et al., 2013). Proses sentrifugasi ulangan dilakukan untuk mendapatkan pelet DNA. Pelet DNA ini kemudian dimurnikan atau ditambahkan air (Huk disimpan atau dianalisis (Langga et al., 2012).

METODE KERJA

a. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini meliputi tabung reaksi, rak tabung reaksi, tabung sentrifus, mesin sentrifus, mesin vorteks, erlenmeyer, gelas kimia, spatula, spuit, dan corong. Bahan yang digunkan dalam praktikum ini meliputi bakteri asam laktat, deterjen, garam, etanol dingin, dan akuades.

b. Prosedur Kerja

1. Disiapkan alat dan bahan.
2. Dimasukkan isolat bakteri asam laktat ke dalam tabung sentrifus.
3. Disentrifus selama 15 menit dan dengan kecepatan 80 rpm.
4. Supernatan dibuang.
5. Dimasukkan 15 mL akuades ke dalam tabung sentrifus berisi natan.
6. Dihomgenkan menggunakan vorteks lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer.
7. Dimasukkan 5 mL larutan deterjen ke dalam erlenmeyer.
8. Disaring menggunakan kertas saring.
9. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
10. Ditambahkan etanol dingin 96% sebanyak 5 mL.
11. Diamati perubahan yang terjadi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dalam praktikum dilakukan isolasi DNA bakteri asam laktat melalui 3 tahapan, yakni lisis, ekstraksi, dan purifikasi. Tahap lisis meliputi pemecahan dinding sel menggunakan deterjen. Menurut Mirnejad et al., (2012), deterjen dapat memengaruhi dinding maupun membran sel bakteri melalui kandungan senyawa kimia dan aktvitas enzim sehingga DNA akan keluar dari sel tanpa merusak DNA. Deterjen dapat melisiskan barier sel secara kimia dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel. Adapun pada tahap ekstraksi dilakukan penambahan garam untuk memberikan kondisi ionik sehingga reaksi berjalan lebih stabil dan juga untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi (Nugroho dan Rahayu, 2016). Pada tahap terakhir dilakukan presipitasi dengan menggunakan etanol dingin. Etanol sebagai pelarut organik akan menurunkan konstanta dielektrik air sehingga ikatan DNA  dengan Na⁺ meningkat dan DNA lebih mudah terpresipitasi. Adapun gaya sentrifugal yang diberikan dalam pengisolasian DNA akan memisahkan massa sel bakteri yang berbentuk padat dari cairan media pertumbuhan. Massa sel akan terendapkan pada dasar tabung sebagai pelet. Selanjutnya, pelet ditambahkan larutan lisis untuk merusak dinding sel bakteri sehingga DNA dapat dikeluarkan (Rachmawati et al., 2013).

Metode isolasi yang digunakan dalam praktikum merupakan metode konvensional, yakni dengan penggunaan SDS. Metode konvensional menggunakan beberapa jenis bahan kimia yang ditentukan volume dan konsentrasinya sesuai dengan target tertentu yang sudah dikembangkan oleh peneliti. Proses isolasi asam nukleat dengan metode ini sangat kompleks sehingga membutuhkan waktu yang lama (Tan et al.,, dalam Syahputra, 2016). Pengembangan metode isolasi selanjutnya telah menggunakan bahan yang siap pakai dan ditambah kolom filter untuk memisahkan senyawa yang tidak terpakai dari asam nukleat. Metode isolasi ini merupakan metode modern, disebut metode kit yang sudah dikomersialkan sesuai dengan target isolasi di antaranya target DNA, RNA, dan protein (Tan dan Yiap, dalam Syahputra, 2016). Penelitian yang dilakukan Syahputra (2016) membandingkan keefektifan kedua jenis metode isolasi DNA (konvensional dan modern). Dari hasil tersebut didapatkan bahwa metode isolasi DNA secara konvensional menunjukkan tingkat konsentrasi dan kemurnian DNA lebih tinggi.

Gambar 1. Hasil Isolasi DNA Bakteri Asam Laktat

Hasil yang diharapkan dalam praktikum adalah didapatkannya DNA murni dari isolat bakteri asam laktat. Namun setelah dilakukan presipitasi, tidak didapatkan DNA terlarut dalam fase air (kiri). Menurut Hidayat (2015), setelah presipitasi DNA, akan terbentuk 3 lapisan akibat perbedaan massa jenis di mana lapisan atas adalah fase air, lapisan tengah adalah protein dan lapisan bawah adalah fase organik (etanol). Lapisan atas merupakan fase air yang mengandung DNA terlarut karena adanya persamaan sifat polar. Hal ini didukung oleh Tan dan Yiap (2009) di mana pada isolasi DNA, akan terbentuk 3 fase di mana fase atas merupakan fase air, interfase meliputi DNA dan protein sedangkan fase paling bawah adalah pelarut organik. Ketiga fase tersebut tampak pada hasil perbandingan (kanan) yang menunjukkan hasil positif adanya DNA terlarut pada fase air. Menurut Hearn dan Ablaster (2010), tidak adanya DNA dapat disebabkan karena kerusakan DNA akibat penghomogenan menggunakan vortex yang berlebihan. Selain itu, kesalahan pada hasil dapt disebabkan karena sedikitnya sel bakteri yang terkandung sehingga DNA tidak tampak.

 

DAFTAR PUSTAKA

Hairuddin, R., 2013. Isolasi DNA dan Amplifikasi, (PCR) Genom DNA Kopi (Coffea sp.) Melalui Proses Elektroforesis Gel Poliakrilamid. Jurnal Dinamika, 4(1), pp.43-48.

 

Hearn, R.P. & Arblaster, K.E., 2010. DNA Extraction Techniques for Use in Education. Biochemistry and Molecular Biology Education, 38(3), pp.161-166.

 

Hidayat, R., 2015. Perbandingan Metode KIT Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan DNA Sapi pada Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan Menggunakan Real-Time PCR (Polymerase Chain Reaction). Skripsi. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

 

Langga, I.F., Restu, M., & Kuswinanti, T., 2012. Optimalisasi Suhu dan Lama Inkubasi dalam Ekstraksi DNA Tanaman Bitti (Vitex cofassus Reinw) serta Analisis Keragaman Genetik dengan Teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains & Teknologi, 12(3), pp.265-276.

 

Mirnejad, R., Babavalian, H., Moghaddam, M.M., Khodi, S., & Shakeri, F., 2012. Rapid DNA Extraction of Bacterial Genome Using Laundry Detergents and Assessment of the Efficiency of DNA in Downstream Process Using Polymerase Chain Reaction. African Journal of Biotechnology, 11(1), pp.173-178.

 

Rachmawati, R., Susilowati, P.E., & Raharjo, S., 2013. Analisis Gen Merkuri Reduktase (MerA) pada Isolat Bakteri dari Tambang Emas Kabupaten Bombana Sulawesi Tenggara. J. Prog. Kim. Si, 3(2), pp.108-123.

 

Sunarno, Muna, F., Fitri, N., Malik, A., Karuniawati, A., & Soebandrio, A., 2014. Metode Cepat Ekstraksi DNA Corynebacterium diphtheriae untuk Pemeriksaan PCR. Buletin Penelitian Kesehatan, 42(2), pp.85-92,

 

Syafaruddin, S., Randriani, E., & Santoso, T.J., 2011. Efektivitas dan Efisiensi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Jambu Mete. Journal of Industrial and Beverage Crops, 2(2), pp.151-160.

 

Syahputra, A., 2016. Evaluasi Metode Isolasi Asam Nukleat dalam Deteksi PCR untuk Patogen Antraknosa, Bulai, Huanglongbing dan Mosaik. Skripsi. Institut Pertanian Bogor (IPB).

 

Tan, S.C. & Yiap, B.C., 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and the Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology, pp.1-11.

 

Utami, S.T., Kusharyati, D.F., & Pramono, H., 2013. Pemeriksaan Bakteri Leptospira pada Sampel Darah Manusia Suspect Leptospirosis Menggunakan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction). BALABA: Jurnal Litbang Pengendalian Penyakit Bersumber Binatang Banjarnegara, 9(02), pp.74-81.

Tidak untuk disalin! 

Artikel ini dibagikan untuk memberi contoh dan menginspirasi:)