Laporan Praktikum Bakteriologi: Pemurnian dan Pembuatan Stok Escherichia coli

Daftar Isi

• Dasar Teori
• Prosedur Kerja
• 1. Pemurnian Bakteri
• 2. Pembuatan Stok
• Hasil dan Pembahasan
• 1. Pemurnian Bakteri Escherichia coli
• 2. Pembuatan Stok Escherichia coli
• Daftar Pustaka

DASAR TEORI

Pemurnian merupakan kegiatan untuk mendapatkan koloni murni mikroorganisme yang ditumbuhkan sebelumnya. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan sebagian koloni mikroorganisme ke dalam media pertumbuhan yang baru, sehingga tujuan pemurnian adalah agar diperoleh biakan murni yang diinginkan tanpa ada kontaminan dari mikroba lain. Pemilihan koloni mikroba yang dimurnikan berdasarkan perbedaan kenampakan morfologi koloni, baik dari segi warna, elevasi, bentuk, dan tekstur permukaan. Pemurnian isolat bakteri dapat dilakukan dengan menggunakan metode gores di mana penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di atas media padat dengan menggunakan ose bulat.

Terdapat beberapa metode cawan gores, yakni dapat dilihat pada gambar berikut.

Metode cawan gores: (a) Goresan T; (b) Goresan kuadran; (c) Goresan radian, (d) Goresan sinambung

Setelah dilakukan pemurnian, maka diperoleh biakan murni. Sel bakteri yang telah mereka tersebut dapat disimpan dalam media agar miring yang sesuai dan tertutup rapat sehingga dapat bertahan dalam jangka waktu yang lama. Proses inokulasi ke agar miring dilakukan dengan metode Sinambung menggunakan ose bulat.

PROSEDUR KERJA

A. Pemurnian Bakteri

1. Dibuat media EMBA dan CCA lalu disterilisasikan menggunakan otoklaf.
2. Media yang telah jadi dituang ke dalam cawan petri lalu didiamkan hingga padat.
3. Isolat dari media EMBA yang telah tumbuh sebelumnya diinokulasikan menggunakan metode gores kuadran ke media EMBA yang baru, begitupun isolat dari media CCA diinokulasikan ke media CCA yang baru dengan metode yang sama.
4. Setelah inkubasi selama 1 × 24 jam, diamati koloni yang tumbuh pada keempat media.

B. Pembuatan Stok Bakteri

1. Dibuat media NA.
2. Media NA yang telah homogen dituang ke dalam tabung reaksi kemudian disterilisasikan menggunakan otoklaf.
3. Media yang telah steril diposisikan agar miring dan didiamkan hingga padat.
4. Isolat bakteri berwarna hijau metalik dari media yang telah tumbuh sebelumnya diinokulasikan ke media agar miring menggunakan metode gores sinambung. Kultur lalu diinkubasi selama 1 x 24 jam.
5. Kultur disimpan di dalam kulkas.

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pemurnian Bakteri Escherichia coli

Gambar 1. Hasil gores E. coli pada media EMBA dan CCA

Dalam praktikum, dilakukan pemurnian bakteri E. coli menggunakan metode gores kuadran. Tujuan dilakukannya pemurnian adalah untuk memperoleh biakan murni dari suatu biakan campuran (Sabbathini et al., 2017). Pada metode gores kuadran, dilakukan dengan 4 kali penggoresan. Daerah pertama merupakan goresan awal sehingga masih mengandung banyak sel bakteri. Goresan selanjutnya dilakukan dengan menarik ujung dari penggoresan sebelumnya sehingga jumlah koloni semakin sedikit dan akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal. Hal ini didukung oleh Sanders (2012) yang mengatakan bahwa dengan metode gores, sel bakteri akan tersebar di permukaan media. Setelah inkubasi, maka sel-sel yang terpisah tersebut akan tumbuh membentuk koloni-koloni yang dapat diamati secara langsung.

Adapun media yang digunakan dalam proses pemurnian adalah dengan menggunakan media EMBA dan CCA. EMBA adalah media selektif yang akan menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif sehingga dapat mendeteksi bakteri E. coli yang merupakan bakteri Gram-negatif (Wahdiniati et al., 2016). Uji positif adanya bakteri E. coli dalam media EMBA ditandai dengan terbentuknya koloni dengan kemilau hijau metalik. Menurut Hardiati et al. (2018), warna tersebut timbul akibat adanya aktivitas fermentasi laktosa dan sukrosa pada media EMBA. Begitupun pada media CCA sebagai media selektif di mana kandungan kromogen Salmon-GAL dan X-β-D-glucuronida yang akan dipecah oleh enzim β-galactoside dan β-glucuronidase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli (Grasso et al., 2000). Disebutkan bahwa enzim β-glucuronidase hanya terdapat pada bakteri E. coli, Shigella, dan Salmonella sehingga dapat menjadi indikator adanya bakteri coliform jenis E. coli (Rice et al., 1990). Isolat murni yang diperoleh selanjutnya akan disimpan sebagai stok dalam agar miring.

 

B. Pembuatan Stok Bakteri Escherichia coli

Gambar 2. Stok E. coli pada media NA agar miring

Pada pembuatan stok, isolat dari kultur E. coli yang telah ditumbuhi sebelumnya diinokulasikan ke media NA miring. Tujuan dibuatnya stok bakteri murni adalah sebagai persiapan uji penelitian lebih lanjut (Suhaeni dan Syakur, 2016), dalam hal ini adalah praktikum karakterisasi. Stok bakteri dapat langsung digunakan untuk uji atau bila tidak digunakan, dapat disimpan dalam lemari pendingin dengan dilakukan peremajaan setiap dua minggu sekali (Dewi, 2010). Menurut Machmud (2001), pada kondisi penyimpanan yang sesuai, laju metabolisme bakteri akan menurun hingga sekecil mungkin namun tetap mempertahankan viabilitasnya. Dalam agar miring yang tertutup rapat, bakteri dapat bertahan hidup dengan baik dalam suhu ruang maupun di kulkas.

DAFTAR PUSTAKA

Dewi, F.K., 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar. Skripsi. Universitas Sebelas Maret, Surakarta.

 

Grasso, G.M., M.L. Sammarco, G. Ripabelli, & I. Fanelli, 2000. Enumeration of Escherichia coli and Coliforms in Surface Water By Multiple Tube Fermentation and Membrane Filter Methods. Microbios, 103(1), pp.119-125.

 

Hardiati, A., Safika, & Pasaribu, F.H., 2018. Antibiotics Resistance Patterns of Escherichia coli Isolated from Poultry in West Java. Proc. of the 20th FAVA CONGRESS & The 15th KIVNAS PDHI, Bali Nov 1-3, pp.113-115.

 

Machmud, M., 2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Buletin AgroBio, 4(1), pp.24-32.

 

Rice, E.W., Allen, M.J., & Edberg, S.C., 1990. Efficacy of β-Glucuronidase Assay for Identification of Escherichia coli by the Defined-substrate Technology. Applied and Environmental Microbiology, 56(5), pp.1203-1205.

 

Sabbathini, G.C. & Pujiyanto, S., 2017. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Genus Sphingomonas dari Daun Padi (Oryza sativa) di Area Persawahan Cibinong. Jurnal Akademika Biologi, 6(1), pp.59-64.

 

Sanders, E.R., 2012. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. JoVE (Journal of Visualized Experiments), (63), p.e3064.

 

Suhaeni, S. & Syakur, A., 2016. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Dangke Asal Kabupaten Enrekang Sulawesi Selatan. Biogenesis: Jurnal Ilmiah Biologi, 4(2), pp.79-83.

Tidak untuk disalin! 

Artikel ini dibagikan untuk memberi contoh dan menginspirasi:)